不同官能团的微塑料对斑马鱼胚胎菌群和代谢功能的影响：一项研究

文 |史与春秋

编辑 | 史与春秋

斑马鱼是研究肠道菌群与宿主相互作用的理想模型，其幼鱼肠道在受精后2d内即开始发育，并在4d内发育完成开始有微生物定殖。

那么环境污染条件下斑马鱼幼鱼肠道菌群变化与代谢功能响应，又对其生物体的早期生长发育和健康效应有何影响呢？

我们选取了3种不同官能团修饰的PS微塑料为研究对象，并以斑马鱼胚胎为受试生物。

然后利用不同组学方法，解析了斑马鱼幼鱼肠道菌群的组成和代谢功能变化，揭示了不同官能团微塑料对斑马鱼幼鱼菌群失调和代谢紊乱的作用过程。

其中PS是环境介质中检出频率较高的一种微塑料聚合物，也是目前研究毒性效应常用的微塑料种类。

因此，我们特地选取了未修饰的PS微塑料、氨基化PS 微塑料（PS—NH 2 ）和羧基化 PS 微塑料（PS—COOH），其直径均为100nm。

而选取相同直径的绿色荧光标记PS微塑料用于生物累积实验，它可以最大激发波长并将最大发射波长控制在488nm和518nm。

需要注意的是，所有微塑料在使用前均要在乙醇中用超声波清洗3次，以去除表面的分散剂等化学物质。

实验中的成年野生型斑马鱼（AB 型）由动物研究所提供，并在实验室的斑马鱼循环水系统中驯化和饲养。

水温保持为（27±1）℃，光、暗周期设置为14/10h，pH在7.0~7.2之间，溶解氧＞7mg·L-1，每天喂食2次活体丰年虾。

我们先利用光线刺激触发斑马鱼的受精行为，然后收集鱼卵并先后用亚甲基蓝溶液和标准稀释水冲洗。

在暴露4h后，使用SZX16体视显微镜筛选健康的胚胎用于后续暴露实验，实验过程遵循OECD 236的规定进行。

根据微塑料在不同水环境中检出的最高环境浓度（4.65mg·L-1），并考虑到其不断积累的特征，我们将实验中微塑料的暴露浓度设置为10mg·L-1 。

在此浓度下，PS 微塑料不会对斑马鱼胚胎的生长发育产生显著影响。

而为了便于观察和计数，我们将绿色荧光标记的PS微塑料用于累积暴露实验，标记该塑料的荧光材料包埋在微塑料内部，这保证在暴露和处理过程中不会发生泄露。

为保证微塑料的分散性，暴露溶液现配现用，暴露组设置为空白对照组、未修饰PS处理组、氨基化PS处理组（PS—NH2 ）和羧基化PS处理组（PS—COOH）共4个处理组。

我们将发育良好的斑马鱼胚胎分别放入直径18cm的玻璃培养皿中，并加入相应的暴露溶液80mL，每组包含150粒受精卵。

所有胚胎均在置顶LED光照培养箱中培育，光、暗周期、水温、pH和溶解氧等水质参数和斑马鱼驯化阶段相同。

暴露期间每天更换90%的暴露溶液以确保微塑料浓度的相对稳定，暴露24h后，收集各组斑马鱼胚胎并在标准稀释水冲洗3次。

随后借助荧光显微镜和高分辨扫描电镜，观察不同官能团微塑料在斑马鱼胚胎中的赋存情况。

接着继续暴露至第5d，在累积暴露实验结束后，我们随机选取30条斑马鱼幼鱼，用稀释水冲洗3次，以除去其表面粘附的微塑料颗粒。

随后，转移幼鱼至冰上使其停止生命活动，并转移至2mL离心管称重并制备全鱼组织匀浆。

这需要采用10%KOH在60℃下消解12h，获取消解液后，我们采用荧光分光光度计测定累积微塑料的荧光强度，并在毒理学暴露周期结束后，每组随机选取5个平行样本。

这里的每个样本需要随机挑选120条幼鱼经冷冻处理后置于2mL离心管中，同时加入500μL 提取液（甲醇:水=4:1，含有2%的L-2氯苯丙氨酸），在–10℃匀浆3min，而后加入200μL氯仿，继续研磨3min。

再经过超声萃取10min后，萃取液用离心机高速离心20min（4℃，12000g）。

反应过程中的色谱条件为∶初始温度60℃，平衡30s后以8℃·min-1的速度升至310℃并维持6min，进样口温度为260℃，载气为高纯氦气，载气流速为1mL·min-1。

而质谱条件为∶离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，扫描方式为全扫描模式，质量扫描范围m/z为50⁓500，扫描频率为3.2scan·s -1 ，进而获得总离子流色谱图。

我们发现，在不同处理之间采用单因素方差分析检验法后，P<0.05为统计的显著性。

那么微塑料在生物累积中的影响又是什么呢？

我们发现，不同官能团PS微塑料在斑马鱼胚胎中的累积情况，包含斑马鱼胚胎上荧光微塑料的累积情况和同时间段经去膜化处理后的胚胎。

PS微塑料处理后，其在斑马鱼胚胎绒毛膜上的生物累积明显增强，但3种PS微塑料处理组之间没有显著差异性。

这表明胚胎绒毛膜是PS微塑料的重要累积场所，并对PS微塑料进入生物体具有一定的保护效果。

同时，去膜化处理后的斑马鱼胚胎卵黄囊中也发现了微塑料的累积。

这表明100nm的PS微塑料可能会穿透绒毛膜进入到斑马鱼胚胎内部中，而这一结果也得到了证实。

因为我们发现斑马鱼胚胎绒毛膜可以有效拦截大尺寸微塑料，但对小粒径的微塑料阻拦效果不佳。

为了进一步证实斑马鱼胚胎绒毛膜对小粒经PS微塑料的拦截效果，我们随后又对斑马鱼胚胎绒毛膜的结构进行了SEM扫描。

结果显示斑马鱼胚胎绒毛膜外侧平滑，存在均匀分布的绒毛膜孔通道，直径约为660nm。

经100nm微塑料暴露后，在胚胎绒毛膜的外侧和内侧同时发现了微塑料的存在，证实了微塑料可以穿过绒毛膜孔。

这也意味着，绒毛膜是斑马鱼胚胎发育前期（从受精至咽囊期）实施自我保护的天然屏障，可以有效控制大颗粒物质的流入或外排。

但尺寸远远小于绒毛膜孔直径的微塑料则可以穿透绒毛膜屏障，累积在胚胎内部的卵黄囊中。

而卵黄是给斑马鱼胚胎早期发育提供营养和能量的关键部位，累积在卵黄囊中的微塑料可能会随着胚胎的发育而逐步转移到胃肠道、肝脏、心脏和大脑等关键部位，进而威胁斑马鱼正常的生长发育过程。

但在暴露120h后，不同PS微塑料在斑马鱼幼鱼体内的累积情况，大概范围介于（143±36）~（175±24）μg·g -1 之间，相应的生物累积系数（BCF）为14.8~17.7，且3种微塑料之间不存在显著差异性。

而PS 微塑料在青鳉鱼体内的BCF在16.8~139.9之间，微塑料的尺寸越小，其生物累积能力越强。

因为考虑到3种PS微塑料在斑马鱼幼鱼体内的BCF均远远小于1000，所以其均不具有生物累积性，但这并不能展现其对斑马鱼代谢功能的影响。

为进一步解析微塑料对斑马鱼代谢功能的影响，我们将不同微塑料处理组的差异代谢物导入 进行分析和拓扑学分析，并筛选出了其潜在的代谢途径。

未修饰的PS暴露显著提高了新霉素、亚油酸以及糖类等相关的合成和代谢功能，而PS—NH 2处理则导致了斑马鱼体内与氨酰 tRNA、色氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等相关的代谢通路受到显著影响。

在PS—COOH暴露组中，斑马鱼幼鱼的三羧酸循环、丙酮酸、苏氨酸和酪氨酸的代谢功能，以及糖酵解等路径受到明显影响。

相较于未修饰的PS，两种官能团修饰的微塑料导致了斑马鱼体内更多代谢途径的变化。

我们整合得到3种微塑料作用下斑马鱼体内受影响的主要代谢途径，结果显示，3种微塑料主要通过改变斑马鱼体内三羧酸循环、糖脂、核苷酸和氨基酸代谢等途径，影响斑马鱼的代谢功能。

在先前研究中，PS微塑料暴露21d后显著改变了斑马鱼在转录水平上的生理和生化功能，引起了斑马鱼肝脏糖脂代谢的紊乱。

同时，微塑料暴露也扰乱了斑马鱼体内脂类、信号分子、脂肪醇代谢和 TCA 循环等功能。

这也证实，PS微塑料对斑马鱼体内糖脂代谢、核酸代谢和能量代谢等多个代谢功能的影响存在一定的差异性。

而这可能是和实验所用斑马鱼所处的生命阶段有关，因为斑马鱼在其生命早期对外源污染物的响应更为敏感。

此外，斑马鱼品系的不同，也会在其生理响应方面存在差异性。

那么我们结合代谢差异物和代谢途径分析发现，PS可以通过下调腺嘌呤和胸腺嘌呤等途径而导致斑马鱼核苷酸代谢过程的紊乱。

PS—NH2暴露则可通过上调苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，而参与到多巴胺等神经递质的合成，进而对斑马鱼幼鱼的神经系统发育产生重要影响，同时也能通过上调果糖-6-磷酸的含量而影响糖酵解过程

其中海藻糖和半乳糖醇是斑马鱼体内糖酵解代谢过程中的关键物质，PS—COOH对其上调作用表明，斑马鱼体内的葡萄糖稳态受到了PS—COOH的破坏。

而三羧酸循环作为生物体内糖类、脂质、氨基酸三大物质代谢转化以及维持能量代谢的重要过程，对斑马鱼的成长起到了重要的影响。

但PS—COOH暴露会导致斑马鱼体内丙酮酸含量的显著上调，这对斑马鱼体内的三羧酸循环影响较大，进而诱导斑马鱼产生自然防御性反应。

已有研究显示，微塑料暴露可以显著改变水生生物的神经发育和行为学响应，影响糖类关键生源物质的代谢过程，进而导致生物体糖脂、氨基酸和三羧酸循环等过程受到明显干扰。

总的来说，斑马鱼胚胎绒毛膜是微塑料暴露早期的主要累积场所，但其不能有效阻隔小粒径微塑料的穿透，而中卵黄囊是微塑料在胚胎内部的关键蓄积组织。

这也说明，3种微塑料在斑马鱼幼鱼体内的累积能力没有显著差异性，其累积系数均相对较小，在斑马鱼生命早期阶段不具有生物累积性。